淘汰临床检验项目、方法及替代实验(2)

　　血清脂蛋白测定始于50年代，最早用纸电泳分析。当时的技术只能将脂蛋白分为α与β两条区带，不能将β与前β区带分开，而且也只能测α与β脂蛋白的相对含量。随着硫酸多糖类化合物(如肝素、硫酸葡聚糖)在分离制备脂蛋白研究中取得成功，1960年前后开始沿用这一原理设计出血清β脂蛋白(继续应用电泳法中的名称)简易比浊测定法。30年来国内通用肝素与β脂蛋白形成复合物，加入两价金属离子(Mn2+或Ca2+)产生混浊沉淀的方法，结果以沉淀物中脂质含量来表示，故又称β脂质测定。此法远比电泳法简单快速，适于分析成批标本，但仍不能区分β与前β脂蛋白。

　　此法的主要缺点有二：

　　1.浊度高低代表β与“前β”脂蛋白的总和(现在多称低密度与极低密度脂蛋白，LDL与VLDL)。LDL的组成主要是胆固醇，而VLDL的组成主要是甘油三酯(TG)。临床上需要知道血清总胆固醇(TC)与TG水平，而β脂蛋白试验不能满足这项要求。当时因直接测定TG尚无简单的方法，所以同时测定TC与β脂蛋白可以大致估计TG是否增高，但这毕竟相当粗糙。当前在心血管病危险因素估计中要求分别测定高密度脂蛋白(HDL)与LDL中的胆固醇(HDL—c与LDL—c)，更非β脂蛋白试验所能表达。

　　2.在测定方法上，因为LDL与VLDL脂质的相对含量以及它们各自的脂质组成均为可变，等量LDL与VLDL所产生的浊度也不一致，所以对β脂质的测定难于制定合适的标准品。各实验室自行制备标准物绘制标准曲线，测出结果没有可比性，根本谈不上“标准化”。有的实验室用硫酸钡人工浊度标准，当然也不可行。所以这项试验的浊度高低只是血脂高低的初步过筛试验而已。

　　可　替　代　的　试　验

　　近20年来脂蛋白生化、代谢与临床研究日益深入，测定计数发展迅速。对高脂蛋白症(包括高胆固醇血症及高甘油三脂血症)及特殊的脂蛋白异常情况的诊断，可以按照以下的程序进行检查。

　　1.血清(浆)外观检查

　　不要忽视这项肉眼观察所能提供的信息。血清混浊通常表示TG升高，将混浊血清装在小试管中，放置4℃冰箱过夜，如血清上浮奶油样层而下部变清者，产示有乳糜微粒(CM)增加(故又称CM试验)，如不分层而保持原先的混浊者表示为VLDL增多，有奶油样顶层而下部依旧混浊者表示CM与VLDL都增多。高胆固醇血症而无高TG者血清不出现混浊。

　　2.TC测定

　　这是脂类分析中最常用的试验。TC高低通常反映LDL-C的高低，但也在一定程度上受HDL-C水平的影响。

　　3.TG测定

　　是高甘油三酯血症的诊断指标。除了餐后外，空腹血中出现CM是少见的，所以空腹血中TG升高代表VLDL增多。

　　4.HDL-C测定

　　HDL有促进胆固醇逆向转运的功能，可能有拮抗动脉壁脂质沉积的作用。HDL-C降低是心、脑血管病的危险因素之一，目前大医院中已将HDL-C测定作为常规检验，也用於流行病学调查。

　　5.LDL-C测定

　　国内多用Friedlewald公式计算LDL-C数值，此公式为，

　　LDL-C=TC—HDL—C—BLDL-C

　　原式采用旧单位(mg/d”，BLDL-C以TG/5代入，意即VLDL—C与血清TG之比为1：5。在病理状态下，此比例有较大变动，一般认为TG高于400mg/d1时计算结果不准确。此外只有TC、TG、HDL-C三项测定都准确可靠，才能计算得 LDL-C的近似值。现在已经有LDL-C直接测定方法，并有试剂盒提供，但在TG过高时，对测定结果也有一定影响。

　　卫生部1991年第18号文件中指定的β脂蛋白后的可替代项目即上述2、3、4三项。临床及实验室工作者应该知道β脂蛋白测定只是过去受技术条件限制所采用的半定量实验，不能具体反映TC、TG及脂羞白谱的变动情况，基层医疗单位也应该创造条件采用新技术，淘汰过时的技术，以提高防治工作水平。

　　血清总胆固醇测定方法

　　血清胆固醇(CHOL)测定方法种类繁多，化学方法大都用有机溶剂提取血清中的CHOL，用特殊试剂显色，然后比色测定。主要显色反应有Liebermann—Burchard(L-B)反应及高铁—硫酸反应等两类。这些方法须用腐蚀性的浓酸试剂，特异性差，干扰因素多，准确测定有赖于从血清中提取胆固醇，并对抽提液进行纯化。因此操作步骤多，不适于常规应用。美国疾病控制中心(CDC)脂类测定标准化实验室所审定的ALBK法，由于抽提液中基本上不存在L-B反应的干扰物，结果准确，为目前国际上通用的参考方法。此法虽然不很复杂，但也不易准确掌握。现在还有少数实验室应用L—B试剂直接显色法、邻苯二甲醛法等，准确性差，已在淘汰之列。

　　在常规工作中现在已普遍应用酶法。此法特异，灵敏，精密，用单一试剂直接测定，既便于手工操作，也适用於。自动分析仪测大批标本;既可作终点法，也可作速率法测定。酶法都采用胆固醇酯酶(CEH)水解胆固醇酯(cE)，同时以胆固醇氧化酶(CHOD)将胆固醇氧化成胆甾烯酮并产生H202终点物的测定则有几种不同的方法。目前普遍应用依赖于H202的显色系统，即Trinder指示反应，试剂包括过氧化物酶(POD)、4—氨基安替比林(4—AAP)和酚(三者简称PAP)。

　　总胆固醇(TC)铡定要求做到标准化，与国际标准取得统一。化学测定的胆固醇标准液应以美国NIST(原NBS)的SRM911b为准，其纯度为99.8±0.1%。国内应制出相应的胆固醇纯品。酶法中常用定值血清作标准，规定用参考方法(ALBK法)定值，定值时须用相当于SRM91Jb的胆固醇纯品配制标准溶液。

　　以下介绍通用的酶法(CHOD-PAP法)。

　　原理

　　血清中的CE用CEH水解，游离胆固醇被CHOD氧化，所产生的H202用Trinder反应显色：

　　CEH

　　CE+H2O--------→胆固醇+脂肪酸

　　CHOD

　　胆固醇+O2--------→△4△甾烯酮+H2O2

　　POD

　　2H2O2+4AAP+酚--------→醌亚胺染料+4H2O

　　红色醌亚胺的最大吸收在波长500nm，吸光度(A)与血清TC量成正比。

　　(二)试剂

　　1.酶试剂

　　组成因不同商品而异，为干粉或冻干品。成分举例如下。

　　磷酸盐缓冲液，pH7.7　　0.3mol/L

　　CEH(假单胞菌)　　　　　≥800u/I

　　CHOD(诺卡氏菌)　　　　　≥400u/L

　　辣根POD　　　　　　　　　≥5000u/L

　　胆酸钠　　　　　　　　　3mmol/L

　　4—AAP　　　　　　　　　0.5mmoi/l

　　酚　　　　　　　　　　　3.5mmol/L

　　表面活性剂(TritonX—100)与稳定剂适量? 此试剂在4℃至少稳定半年。复溶后在4℃稳定二周。

　　2.参考标准

　　以ALBK法定值的混合血清，TC浓度在5.2mmol/L(200mg/d1)左右。冻干品可在4℃存放一年，临用前以水复溶。

　　(三)测定操作

　　标本为及时分离的空腹血清：肝素或EDTA抗凝血浆，放置室温中应于当天测定，存放4℃冰箱中可在5天内测定。

　　终点法：标本管与标准管中分别加入标本与定值血清各10ul，酶试剂1.00ml，混匀后在37℃放置5分钟，或20—25℃、10分钟后用光度计比色，以酶试剂为空白，波长500nm，呈色稳定至少1小时。

　　计算：　　　　　　　　　　　　标本管A

　　血清TC(mmol/L)=---------------×定值血清TC(mmol/L)

　　标本管B

　　本法线性范围：0—13mmol/L(0—500mg/L)

　　参考值：

　　人群TC水平因生活条件而异，随年龄增长而上升。中青年男子略高於女子，老年女子高于男子。中、老年人合适水平为<5.2mmol/L(<200mg/dl)，5.2—6.5mmol/L(200—250mg/d1)为临界值(或轻度偏高)，>6.5mmol/L(>250mg/d1)为高胆固醇血症(危险水平)，>7.8mmol/L(>300mg/d1)可视为严重的高胆固醇血症。

　　(四)附注

　　1.试剂甲两种酶(CEH和CHOD)的质量十分重要。CEH必须能有效地水解各种脂肪酸(包括花生四烯酸)的胆固醇酯，CHOD氧化胆固醇完全。选用试剂盒时可以测试对血清标本胆固醇的反应速度。好的试剂一般能在5分钟(有的只要1—2分钟)内;反应达到终点，反应不能在10分钟内完成的试剂不宜采用。其原因可能是原酶质量不好，或酶用量太少。后者可便TC高浓度时的测定值偏低。按本文所述试剂配方，血清标本与酶试剂用量的适当比例为1：100，此时测定范围上界达13mmol/L(500mg/dl)。过高地提高血清比例，会使测定上限降低。如果标本中TC浓度超过13 mmol/L，可用生理盐水稀释后重新测定

　　2.指示反应选择最常用的Trinder法，主要优点是所生成的红色复合物在低POD活力下也能形成，溶解度高，对自氧化不敏感，线性范围宽，颜色稳定。此反应中可以用酚或苯胺的衍生物代替酚·;也可以用高灵敏度的2羟—3.5二氯苯磺酸：2、4、6三溴一3羟苯甲酸等为色原。但在临床应用中只要能兼顾TC与HDL-C测定，灵敏度适当的试剂即可。

　　3.血清中的胆固醇与纯胆固醇溶液(醇溶液或有助溶剂的水溶液)在酶作用下的反应速度不一致，原因不仅在于前者CE占70%，而后者为游离胆田醇，而且还有作用时的基质不同，不同酶制品对CE的水解程度不同，血清中干扰物的存在等因素。所以现在多主张用定值血清为参考标准。如果采用准确定值的血清，用任何合格的商品试剂都可测出基本一致的结果。为了使TC测定符合国际标准化，定值血清的准确性最好与CDC参考血清核对。

　　4.干扰因素

　　血清维生素c 30mg/L、胆红素0.1g/L时对Trimder反应不会有明显干扰，过高可使结果偏低。血红蛋白可能引起正干扰。血清中其他固醇类物质含量甚微，不引起明显干扰

　　5.本法精密度好，在仪器稳定及操作熟练的情况下，批内CV<1%，批间CV<2%。

　　二、血清高密度脂蛋白胆固醇测定

　　HDL是血清中颗粒数最多的脂蛋白，一般可分为HDL2及HDL3两部分。流行病学及临床研究证明，HDL-C减少(主要是HDL2—C减少)是冠心病的危险因素后，测定HDL-C的需求不断增加。因为HDL中含蛋白质与脂质各半，脂质中主要为磷脂与胆固醇，通常以测定胆固醇含量(HDL-C)代表HDL水平。我国人HDL-C占血清TC的28%一30%。测定的第一步是将HDL与其他脂蛋白分离。现在临床检验中大都用大分子多阴离子化合物与两价阳离子沉淀LDL与VLDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇。早期用肝素—Mn2+为沉淀剂，有时VLDL沉淀不完全。后来美国脂质研究中心(Lipds ResearchCenter，LRC)推荐硫酸葡聚糖(DS)—Mn2+法，所用DS分子量50000，法国Sochibo产品，昂贵而不易购得。现今国内外试剂盒大都用磷钨酸(PTA)—Mn2+沉淀，试剂价廉易得，使用方便，结果与肝素—Mn2+法和DS—Mn2+法基本一致。以下介 绍此法。

　　(一)原理

　　血清中含apoB的脂蛋白[包括LDL、VLDL与Lp(a)]经PTA—Mn2+沉淀后，上清液HDL，其胆固醇含量用酶法测定(同TC测定)。

　　(二)试剂??

　　1.沉淀剂

　　称取PTA 0.440g与MgCl2·6H20 1.10g(均用分析试剂)，溶于80ml蒸馏水中，以lmol/LNaOH液校pH至6.15(约用1.3m1)，然后以蒸馏水定容至100ml，此试剂至少稳定一年。

　　2.酶试剂? 同TC测定。

　　3.参考标准? 低胆固醇的定值血清。或将TC测定用定值血清适当稀释(1:2或1:3)后用。

　　(三)测定操作

　　用早晨空腹(12小时)血，当天上午测定。如需冰冻保存，只能冻一次，化冻后即测定。

　　于小离管中加血清200μ1，沉淀剂200μ1，充分混合，室温放置10分钟后离心(3000转/分钟，15分钟)，吸取上清液测胆固醇，按表1操作。

　　表1? 血清高密度脂蛋白胆固醇酶法测定的操作

　　空白管标准管标本管

　　上清液(u1)?--50

　　定值血清(u1)-25-

　　蒸馏水(u1)5025-

　　酶试剂(m1)2.002.002.00

　　混匀，敢置37℃、5分钟(时间可随试剂盒而定)后，用光度计500nm测吸光度(A)

　　计算： 　　　　　　　　　　标本管A

　　HDL-C(mmol/L)=--------------X定值血清胆固醇(mmol/L)

　　标本管B

　　(四)参考值

　　成年男性1.16—1.42mmol/L(45—55mg/d1)，女性1.29—1.55mmol/L(50—60mg/d)，随年龄的变动很小。通常以0.9mmol/L(35mg/皿)以下为明显偏低。

　　(五)附注：

　　1.血清在室温下放置时，各类脂蛋白之间还会进行脂质交换，游离胆固醇不断酯化，故须及时测定，否则应低温保存。

　　2.沉淀后的上清液必须澄清，在血清严重浑浊时LDL与VLDL不易沉淀完全，此时可用生理盐水将血清作1：1稀释后再行沉淀，测得结果乘以2。

　　3.血清加沉淀剂后必须在4小时内完成胆固醇测定

　　4.美国CDC制备的HDL-C参考血清需要与标本同时进行沉淀及胆固醇测定两个步骤，在一60℃保存可稳定6个月，每小管化冻后只供一次使用。CDC对HDL-C测定的准确性有较高要求，血清HDL—C水平<40mg/d1、40—59.9mg/dl及>60mg/d1时，重复测定的最大可允许偏差分别定为2.5，3.0及3.5mg/d1。国内HDL-C测定方法不统一，尚无合适的参考物及质控血清供应，各地报道的参考值差异较大。

　　三、血清低密度脂蛋白胆固醇测定

　　前面已述及LDL-C的Friedewald公式计算法，现在简单介绍直接测定法，即选择性沉淀LDL的方法，这类方法有几种，例如有的试剂盒应用肝素—枸椽酸钠沉淀法，其缺点是要严格控制反应pH。所以现在用聚乙烯硫酸(PVS)沉淀法者较多，如Boehringer试剂盒为美国LRC所选用。

　　(一)原理

　　用PVS选择性沉淀血清中的LDL，测出上清液中的胆固醇代表HDL-C与VLDL-C之和，所以TC减去上清液胆固醇即得LDL-C值。试剂中含EDTA用以去除两价阳离子，避免VLDL共同沉淀。适量的中性多聚物(聚乙二醇独甲醚，PEGME)用以加速沉淀。胆固醇测定同TC测定。

　　(二)试剂?

　　1.沉淀剂

　　每l00ml中含PVS钾盐30mg，EDTA·Na2—2H20186mg及PEGME 16ml。可在4℃冰箱存放，至少稳定3个月。(PEGME为粘稠性液体，要确保加量准确。)

　　2.酶试剂　　同TC测定。

　　3.参考标准　　同TC测定用定值血清。

　　(三)操作步骤

　　用早晨空腹血清。如在4℃存放不得超过4天，深低温保存只能冻一次，化冻后即须测定。於小离心管中加入血清200μl，沉淀剂100μl，混合，室温放置15分钟，离心(3000转/分钟，15分钟)，取上清液按表2操作.

　　表2? 血清低密度脂蛋酶法测定的操作手续

　　空白管标准管标本管

　　上清液(u1)?--30

　　定值血清(u1)-20-

　　蒸馏水(u1)3010-

　　酶试剂(m1)2.002.002.00

　　混合后，放置37℃，5分钟，用光度计测吸光度(A)，波长500nm。

　　计算：　　　　　　　　　　　　　　标本管A

　　上清液胆固醇 (mmol/L)=---------------X定值血清胆固醇(mmol/L)

　　标本管B

　　LDL-C(mmol/L)=TC一上清液胆固醇(mmol/L)

　　(四)参考值

　　LDL-C水平随年龄上升，中、老年人平均约2.7—3.lmmol/L(105—120mg/dL)。一般以3.36mmol/L(130mg/d1)以下为合适水平：4.14mmol(160mg/d1)以上为危险水平;3.36—4.14mmol之间为危险边缘或程度危险(危险是指动脉粥样硬化发生的潜在危险性)。

　　(五)、附注

　　1.本法沉淀物中也包括Lp(a)，因Lp(a)胆固醇较低，通常对LDL-C测出结果不作校正。

　　2.VLDL很高时影响LDL沉淀。血清甘油三酯在4.5mmol/L(400mg/d1)以下时，与超离心结合沉淀法(美国LRC法)结果一致。甘油三酯4.5mmol/L以上时，多数标本测定结果仍与LRC法一致，部分标本会因LDL沉淀不完全而使结果偏低。故在血清严重混浊时，可将血清稀释一倍后测定。

　　3.干扰因素除高VLDL外，显色反应的干扰物同TC测定。

　　4.血清与沉淀剂混合后，放置时间不得超过一小时。

　　5.本法精密度好，批内与批间CV<2%。

（实习编辑：陈战锋）

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