淘汰临床检验项目、方法及替代实验(3)

　　汰血糖的碱性铜还原测定法，采用酶法或邻甲苯胺法

　　淘 汰 的 理 由

　　测定血糖的方法很多，可分为三大类：氧化还原法，缩合法和酶法。60年代以前，主要采用氧化还原法。国内用得最多的是1920年福林一吴宪提出的方法，其原理是：利用在碱性溶液中，葡萄糖能将硫酸铜试剂中的Cu2+还原成Cul+，再与磷钼酸反应，生成一个结构尚不清楚的蓝色化合物～钼蓝，其色度与葡萄糖含量成正比，进行血糖测定。此方法的缺点是：

　　Cu1+不稳定，在空气中容易被氧化，使测定结果偏低。

　　生成物钼蓝呈色不稳定，可逐渐褪色，同时吸收光谱亦改变，影响测定的准确性。

　　特异性差。血中的其他还原性物质，如谷胱甘肽，葡萄!糖醛酸;巯组氨酸三甲内酯和抗坏血酸等，都可参与反应，干扰测定，使结果偏高。

　　操作步骤繁琐，需制备去蛋白血滤液，离心或过滤，煮声加热，不能实现自动化。由于这些缺点，国际上早已淘汰此法

　　替　代　方　法

　　卫生部临床检验中心血糖测定专题协作组于1984年推荐用葡萄糖氧化酶比色法测定血糖，可大大提高测定的特异性，准确度和精密度。目前已有国产葡萄糖过氧化酶和氧化物酶，并有多家生产单位生产葡萄糖氧化酶法测定血糖的试剂盒，基本上能满足临床需求。

　　己糖激酶法测定血糖的特异性较氧化酶法更高，是目前公认测定血糖的参考方法。国内有少数生产单位生产试剂盒，有条件的单位可以采用。

　　邻甲苯胺法测定血糖的特异性也好，但操作较繁，试剂有强腐蚀性、刺激性及致癌性，在没有条件得到酶法试剂盒的地方，可以考虑用此法。

　　一、葡萄糖氧化酶法测定血糖

　　(一)原理

　　在葡萄糖氧化酶的催化作用下，葡萄糖被氧化生成葡萄糖酸并产生一分子过氧化氢。过氧化享被偶联的过氧化物酶? 催化放出氧，后者将试剂中的4-氨基安替比林偶联酚(色原性氧受体)的酚氧化，并与4-氨基安替比林结合生成红色的醌类化合物。

　　(二)试剂

　　1、磷酸缓冲液0.1mol/L　pH7.0

　　溶解无水磷酸氢二钠8.67g，无水磷酸二氢钾5.3g，于约800ml蒸馏水中，用少量1mol/L氢氧化钠或盐酸调溶液pH至7.0，然后用蒸馏水稀释至1000ml。

　　2、酶试剂

　　取葡萄糖氧化酶1200单位，过氧化酶1200单位，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠t00mg，溶于上述磷酸缓仲液约80ml左右，调pH于7.0。再加上述磷酸缓冲液至100ml，置冰箱保存，至少可稳定3个月。

　　3、酚试剂

　　酚100mg溶于100ml蒸馏水中。(酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g/L的溶液，置棕色瓶内保存，用时稀释)

　　4、酶酚混合试剂

　　取酶试剂和酚试剂等量混合，在冰箱内可保存1个月

　　5、12mmol/L苯甲酸溶液

　　溶解苯甲酸1.4g于约800ml蒸馏水中，加温助溶，冷却后，置1L容量瓶内，加蒸馏水至1000ml。

　　6、葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)

　　无水D-葡萄糖置80℃烤箱内干燥恒重，放置室温后，精确称取1.802g，以12mmol/L苯甲酸溶液溶解并移至100ml容量瓶内，再以12mmol儿苯甲酸溶液稀释至100ml，混匀。放置2小时后方可使用。

　　7、葡萄糖标准工作液(5mmol/L)

　　精确吸取葡萄糖标准贮存液5ml，置于100ml容量瓶内，用12mmol/L苯甲酸溶液。稀释至刻度，混匀。

　　8、蛋白沉淀剂

　　溶解无水磷酸氢二钠10g，钨酸钠10g于800ml蒸馏水中，加入lmol/L盐酸125ml，最后用蒸馏水稀释至1000mml。

　　(二)操作

　　1、血浆(清)葡萄糖直接测定

　　(1)取数支16X100mm试管按表1进行操作。

　　表1 血浆(清)葡萄糖直接测定步骤

　　加入物(ml) 测定管 标准管 空白管

　　血清 0.02— —

　　葡萄糖标准工作液 — — —

　　蒸馏水 — — 0.02

　　酶酚混合试剂 3.03.03.0

　　混匀，37℃保温15分钟，波长505nm比色。以空白管调零。

　　(2)计算

　　测定管吸光值

　　血糖=-------------×5

　　标准管吸光值

　　2、测定去蛋白血滤液的葡萄糖

　　用全血标本测定时，先制备去蛋白血滤液。取蛋白沉淀剂lml，加入全血50μl，混匀，室温放置7分钟后离心。同样处理葡萄糖标准工作液，取上清液测定，按表2.进行操作。

　　表2　用去蛋白血滤液测定葡萄糖操作步骤

　　加入物(ml)测定管 标准管 空白管

　　去蛋白血滤液 0.5— —

　　处理后葡萄糖标准工作液 — 0.5—

　　蛋白沉淀剂 — — 5

　　酶酚混合试剂 3.03.03.0

　　混均，37℃保温15分钟。波长505nm比色，以空白管调零

　　计算：同前

　　(四)参考值：

　　空腹血糖为3.89～6.1lmmol/L(70～110mg/d1)

　　惯用单位换算成法定单位：mmol/L=0.556Xmg/d1

　　(五)附注

　　1、葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄耱大约36%为α型，64%β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应。本测定采用终点法，保温15分钟，可达到完全自发变旋过程。新配制的葡萄糖溶液放置2小时以上(最好过夜)，待变旋千衡后方可应用。

　　2、第二步反应涉及过氧化物酶，其特异性不如葡萄糖氧化酶反应高。有些物质，如尿酸、胆红素、谷胱甘肽与氧受体色.奉竞争结合过氧化氢，抑制反应，使结果偏低。

　　3、标本最好用草酸钾—氟化钠抗凝血浆。

　　①抗凝剂的配制：取草酸钾6g，氟化钠4g，加蒸馏水溶解至lOOml。

　　②抗凝管的制备：吸取抗凝剂0.1ml到试管内，在80℃下烤干，可抗凝血液2~3ml，在3~4天内不凝固，并抑制糖分解。

（实习编辑：陈战锋）

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