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4种抗真菌药物的体外敏感性监测

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核心提示:研究氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对948株真菌的体外抗菌活性。方法:真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京协和医院住院患者提供的标本。分别采用酵母菌纸片扩散法敏感试验,Mueller-Hinton琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝,其他操作类似于美国国家临床实验

  研究氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对948株真菌的体外抗菌活性。方法:真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京协和医院住院患者提供的标本。分别采用酵母菌纸片扩散法敏感试验,Mueller-Hinton琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝,其他操作类似于美国国家临床实验室标准委员会M2-A6细菌药敏试验法;以及ATB? FUNGUS 2敏感试验两种方法。结果:白念珠菌最常见,占59%,其次为热带念珠菌占15%,光滑念珠菌占13%,克柔念珠菌占2%,烟曲霉占2%和近平滑念珠菌占2%、四种药物对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较高的抗菌活性。结论:抗真菌药的类型不同,对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异,伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌:白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性。

  [关键词]

  抗真菌药;微生物敏感试验;真菌

  真菌感染已成为白血病,淋巴瘤,免疫抑制,长期使用广谱抗生素,中心静脉插管,中性粒细胞减少,? 烧伤,低体重的早产儿,高APACHEⅡ积分,血液透析,骨髓或器官移植,胃肠道手术和机械通气等特殊人群的严重感染性疾病。过去临床对真菌感染的经验治疗主要选择三唑类利两性霉素B,但近10年真菌的种类发生了明显的变化,有高达77%的酵母菌菌血症是非白念珠菌引起的,它们对抗真菌药可以产生耐药性,酵母菌感染的治疗面临新的挑战[1,2],因此,对威胁生命的真菌感染的患者,进行真菌药敏试验非常重要。为调查真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性,我们采用纸片扩散法和ATB FUNGUS 2两种方法测试948株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。

  材料与方法

  一、菌株来源

  从2004年1月至2005年4月北京协和医院患者临床血液、尿液、胸腹水、脑脊液和下呼吸道标本中分离出可能致病的948株真菌。见表1、2。采用ChromG A显色培养基鉴定白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌,其他念珠菌采用VITEK YBC卡鉴定到种的水平。

  表1? 948株17种真菌所占百分比

  菌株 株数(%)

  白念珠菌57359

  热带念珠菌14915

  光滑念珠菌12613

  克柔念珠菌222

  烟曲霉222

  近平滑念珠菌212

  葡萄牙念珠菌111

  黄曲霉71

  新型隐球菌51

  青霉属40

  土曲霉20

  季也蒙念珠菌10

  念珠菌属10

  无名念珠菌10

  镰刀霉10

  头状地霉10

  酿酒酵母10

  表2? 6种真菌在2004年-2005年的分离情况

  真菌名 2004年1-12月2005年1-4月

  白念株菌468104

  热带念珠菌13315

  光滑念珠菌9528

  克柔念珠菌211

  近平滑念珠菌139

  烟曲霉202

  二、抗真菌药

  氟康唑,25μg/片,未开封的纸片-20℃保存,开封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2试条,含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B。

  三、真菌药敏试验法

  1.纸片扩散法敏感试验

  采用2003年美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS)建议的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南,在Mueller-Hinton(MH)琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝[3],在1L MH琼脂中,加入0.1ml美蓝(methyleneblue,Merck BP 1973产品)贮存液(0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮存液)和20g葡萄糖。高压15min,121℃灭菌,水浴至55℃倾入4mm厚平皿备用。敏感试验其他操作步骤,与标准的细菌纸片法药敏试验相似,酵母菌悬液用无菌盐水比浊至0.5号麦氏管浊度,酵母菌量约为1×106~5×106/ml

  2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

  ATB FUNGUS 2试条包括16对凹形杯。第一对不含任何抗真菌剂,用作阳性生长对照。另外的15对包含不同浓度的4种抗真菌剂,用于测定最小抑菌浓度(MIC)。将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中,并接种到试条上。孵肓后,通过肉眼判读凹形杯中液体的生长情况,获得MIC。试验条采用手工接种用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基,避免产生气泡,使用ATB电子移液管在每个凹形杯中加入135μl的ATB F2培养基(大约3×104酵母菌/毫升或4×104酵母菌/凹形杯)。将一个盖子放在试条上,把试条放入一个密闭容器或是—个装有吸潮纸的GENbox型广口瓶里,在有氧条件下35℃(±2℃)的环境中,念珠菌属要培养24小时(±2小时),新型隐球菌要培养48小时(±6小时)。对念珠菌属来说,如果在生长质控指示的凹形杯中生长不充分,24小时培养后,很难或是不可能读出试条的MIC,这时要在同样的环境下再培养24小时。

  四、药敏指控

  采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌环直径范围为28-39mm

  五、结果判读

  1.纸片扩散法敏感试验

  读取抑菌环直径近似到mm,在大约80%抑制区判读为测量边界。在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落(<20=可忽略不计,采用BIOMIC电子自动阅读系统读取抑菌环直径(mm),并自动换算出相应的最低抑菌浓度(MIC)值(mg/L)[4]。氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解释标准见表3。

  表3 氟康唑和5-氟胞嘧啶纸片扩散法的抑菌环直径和相应MIC的解释标准

  抗真菌药 氟康唑氟康唑5-氟胞嘧啶

  抑菌圈直径/mmMIC(mg.l/l)MIC(mg.l/l)

  敏感(S)≥19≤8≤8

  剂量依赖性敏感(SDD)15-1816-3216-32

  耐药(R)≤14≥64≥64

  2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

  通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况。为方便肉眼判读,把试条放在黑暗的背景下。对于每一个抗真菌制剂,从低浓度开始,与生长对照杯状凹比较,记录每一个杯状凹的生长得分见表4。对于两性霉素B,最小抑菌浓度(MIC)应该判断为省长完全受抑制的测试杯的浓度(即得分为“0”的测试杯)在杯状凹外围存在一个(或几个)散在的菌落或生长迹象,应记录为“1”分。对于氟康唑,伊曲康唑和5—氟胞嘧啶,鉴定可能存在拖尾生长,最小抑菌浓度(MIC)对应的测试杯得分可以是“2”,“1”,或是“0”分。且在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。[5]

  表4.凹形杯的生长与得分

  定义 得分

  和生长对照完全一样4

  比生长对照有轻微减少3

  比生长对照孔明显减少2

  非常微弱的生长1

  没有生长0

  六、数据分析

  文中所得表格采用WHO耐药监测组提供的软件WHONET5.3分析所得。

  结? 果

  909株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和5—氟胞嘧啶的药敏试验结果见表5。

  菌株数<10株的菌种未参加分析,,表5显示采用纸片扩散法敏感试验结果:氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性为23.8%~100%。采用ATB FUNGUS 2敏感性检测结果:其中热带念珠菌的MIC50为0.125~l,MIC90为0.5~1.6。

  四种药物对白念珠菌、热带念珠菌有较高的抗菌活性。氟康唑对光滑念珠菌有较低的抗菌活性,其MIC50和MIC90范围明显高于两性霉素B和伊曲康唑,两性霉素B和伊曲康唑比氟康唑对这2种念珠菌有较高的抗菌活性。且伊曲康唑和两性霉素B对烟曲霉有较高的体外抗菌活性。

  表5? 6种真菌对抗真菌药物的体外敏感性

  真菌名株数抗真菌药耐药%中介%敏感%MIC50MIC90MIC平均值MIC范围

  白念株菌468氟康唑*01.198.9

  104氟康唑7.7092.30.540.7020.25-256

  104伊曲康唑0.1250.50.1950.016-8

  103两性霉素B0.50.50.4970.25-0.5

  1045-氟胞嘧啶1.9097.10.50.50.5810.19-128

  热带念珠菌 133氟康唑*0.80.898.5

  15氟康唑6.76.786.71161.3820.25-128

  15伊曲康唑0.12510.2390.125-4

  15两性霉素B0.50.50.4770.25-0.5

  155-氟胞嘧啶001000.50.50.50.5-0.5

  光滑念珠菌 95氟康唑*12.63.284.2

  27氟康唑7.418.574.14324.5480.25-512

  26伊曲康唑0.540.50.125-8

  26两性霉素B0.50.50.4620.016-1

  285-氟胞嘧啶03.696.40.50.50.4430.032-32

  克柔念珠菌21氟康唑*57.11923.8

  1氟康唑64646464-64

  1伊曲康唑0.50.50.50.5-0.5

  1两性霉素B0.50.50.50.5-0.5

  15-氟胞嘧啶2222-2

  近平滑念株菌 13氟康唑*00100

  8氟康唑0.580.7710.5-8

  9伊曲康唑0.1250.50.1350.062-0.5

  9两性霉素B0.50.50.4290.125-0.5

  95-氟胞嘧啶0.50.50.3550.023-0.5

  烟曲霉17伊曲康唑0.51.50.5880.19-2

  18两性霉素B0.2560.3790.006-64

  155-氟胞嘧啶1642.0140.032-64

  讨论

  本研究提示:氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠闰有较高的抗菌活性。文献报道真菌血流感染自1980年的5.4%增加至1990年的9.9%,念珠菌菌血症的病死率为38%[6]。在美国流行病学研究发现,白念珠菌过去是最常见的念珠菌病的病原菌,但近来检测结果提示白念珠菌仅为55%,非白念珠菌为45%[6]对烟曲霉而言,伊曲康唑比两性霉素B有较低的MIC值,伊曲康唑对烟曲霉有较高的抗菌活性。对非白念珠菌中的光滑念珠菌和克柔念珠菌,伊曲康唑对光滑念珠菌的抗菌活性低于两性霉素B,氟康唑对这两种念珠菌显示出较高的耐药性,尤其对克柔念珠菌。本研究结果表明:抗真菌药的类型不同,对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异,伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌:门念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性;伊曲康唑、两性霉素B对烟曲霉有较高的抗菌活性;氟康唑对克柔念珠菌和部分光滑念珠菌表现出较高的耐药性,但伊曲康唑试验株数较少,无法评估。

(实习编辑:陈战锋)

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