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血浆凝血酶原时间测定操作

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核心提示:在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后,加入试剂。加入试剂后,采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程(纤维蛋白原转化为纤维蛋白)中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定,可以做出凝血曲线,通过Percentage Detection Method法求得凝血时间。

  一、项目名称:

  血浆凝血酶原时间测定(prothrombin time ,PT)

  二、检验方法名称:

  凝结法

  三、方法学原理:

  在确定的血浆样本经过一定时间的加温后,加入试剂。加入试剂后,采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程(纤维蛋白原转化为纤维蛋白)中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定,可以做出凝血曲线,通过Percentage Detection Method法求得凝血时间

  四、方法学溯源:

  凝血酶原时间(PT)测定是Quick于1935年创立的。在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶(人脑、兔脑、胎盘及肺组织等制品的浸出液)和离子,使凝血酶原变为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需要的时间即凝血酶原时间。其凝固时间取决于凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅰ的水平。该试验是反映外源凝血系统最常用的筛选试验。

  五、仪器:

  (一)型号:Sysmex CA—1500自动血液凝血分析仪

  (二)分析和计算参数:

  1.处理量:约120个测试/小时

  2.所需样本量:50μl

  3.检验时间:在最长检验时间之内测出结果,典型最长检验时间:100秒

  4.重复性:CV≤2%

  5.计算参数:凝血酶原活动度(PT%)

  凝血酶原比值(PT R)

  国际标准化比值(INR)

  六、试剂及配套品:

  (一)试剂:

  1. 凝血活酶含钙试剂(Thromborel® S)

  (1)商标:德灵(DADE BEHRING)

  (2)包装规格:Pack for 10×4ml

  (3)代码:No.OUHP 29 , or

  (4)参数:ISI(国际敏感度指数)=0.97

  (5)成分:

  1)Thromborel® S Reagent :

  a. 冻干人胎盘促凝血酶原激酶(lyophilized human placental thromboplastin)

  b. 氯化钙 (calcium chloride)

  c. 稳定剂 (stabilizers)

  2) 防腐剂(Preservatives):

  a.庆大霉素(Gentamicin)(0.1g/L)

  b. 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazol-3-one and 2-methyl-4-isothiazol-3-one)(最大量 20mg/L)

  2.佛罗那巴比妥缓冲液(Dade® Owren'S Veronal Buffer)

  (1)商标:德灵(DADE BEHRING)

  (2)包装规格:Pack for 10×10ml

  (3)代码:B4234-25

  (4)成分:

  1)2.84×10­²M的巴比妥钠 (sodium barbital)

  2)1.25×10­¹M的氯化钠 (sodium chloride)

  3) PH 7.35±0.1

  3. 清洗液(Cleaning)

  2%次氯酸钠溶液(自配)

  (二)配套品:

  1.标准血浆(Standard Human Plasma)

  (1) 商标:德灵(DADE BEHRING)

  (2) 代码:No. ORKL

  2.校准质控血浆(Ci-Trol®)

  (1) 商标:德灵(DADE BEHRING)

  (2) 代码:Level 1, B4244-10

  Level 2, B4244-20

  Level 3, B4244-30

  3.质控血浆(Control Plasma)

  (1) 商标:太平洋(Pacific Hemostasis)

  (2) 代码及规格:Level 1 (Normal), 100595 10×1ml

  Level 2 (Abnormal), 100596 10×1ml

  Level 3 (Abnormal), 100597 10×1ml

  七、操作步骤:

  (一) 开机:开机前,先打开连机的打印机。按下机器右边的POWER按钮。开机后机器进行自检,当屏幕上边显示“Ready”时可以进行试验。

  (二)洗针:在主屏幕上选“Rinse Probe”,然后按下“Execute”进行洗针。

  (三)准备试剂:按照仪器试剂位置程序要求,把每一项的试剂准备好,放在相应的位置。(注:PT试剂的配制:在冻干粉试剂瓶中加入蒸馏水4ml,于37ºC温箱或水浴箱中放置30min)。

  (四)准备标本:将室内质控和离心好的样本放在相应的样本架上(一个架子可放10个样本),准备好放在进样器上。

  (五)准备反应杯:打开仪器上盖装反应杯的盖子,查看反应杯是否够量,需及时添加。

  (六)输入试验项目:按下主菜单上的“Work List”键,在试验项目键点击PT,使PT键由“—”变为“O”。如有需要按屏幕下的“Repeat”键,仪器会自动重复十个样本的检测项目与第一个样本相同。屏幕右边的光标移动键,按下“NEXT”表示翻到下一个界面,按“↑”表示向上移动光标,“←或→”表示下一个界面试验项目。

  (七)输入样本号:按下“ID No.Entry”,按顺序输入样本的序号或病人的病历号。

  (八)开始检测:待一切准备工作就绪,按下仪器右上角“START”键,仪器开始工作。

  (九)查看结果:返回主屏幕,检测的项目如果由“◎”变为“●”表明此试验已经完成,然后按下“Stored Date”(储存结果)键,屏幕会换到结果显示界面,检测的结果会自动传输到此画面,如果查看反应趋势图,按下边第一个菜单“Graph”,查看凝集趋势、吸光度、结果等。

  (十)洗针:当做完一批标本以后,需要洗针,按下“Rinse Probe”,然后按下“Execute”进行洗针。

  (十一)关机:回到主屏幕下,在洗完针以后方可关机,切断电源,关闭打印机。

  八、 参考范围:PT(sec):11—14 s

  PT% :80%—120%

  PT R :1±0.15

  INR :0.8—1.5

  九、 临床意义:

  (一)PT延长

  1.外源凝血系统的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纤维蛋白原减低,如先天性某因子缺乏症和低(无)纤维蛋白原血症,但均很少见,获得性的见于DIC、原发性纤溶、维生素K缺乏症、肝脏疾病等。

  2.血循环中抗凝物质增加,如肝素或FDP增多等。

  (二)PT缩短 口服避孕药、高凝状态和血栓性疾病等。

  (三)用于香豆素类等口服抗凝剂的监控

  1.一般认为以维持PT值在参考值的2倍左右(1.3—2.5倍)即25—30s,或PT R为1.3—1.5(最大不超过2)为宜。

  2.PT%应控制在40%以上,减低到40%有出血倾向。

  3.不同情况下口服抗凝药治疗的最佳抗凝强度时INR的范围:

  (1)术前两周或术中口服抗凝药,INR为1.5—3.0;

  (2)原发或继发静脉血栓的预防,INR为2—3;

  (3)活动性静脉血栓、肺梗塞、复发性静脉血栓的预防,INR为2—4;

  (4)动脉血栓栓塞的预防,心脏换瓣术后,INR为3—4.5。

  十、病人准备和标本要求:

  (一)采血时,首先应该确认病人姓名,并且将姓名和编号写在真空采血管的标签处。

  (二)尽可能保证每次采血都在同样的条件下进行,即病人处于休息状态,并且在早餐前采血。

  (三)凝血实验标本最好不与其它实验一起采集,否则由于标本的分配、分装等而使血液停留在针管的时间延长。

  (二)取血时,病人应松弛,环境温暖,防止静脉痉挛,止血带的压力应尽可能小,取血速度平稳顺利,防止产生气泡。,。

  (三)用定量为3毫升的一次性枸橼酸钠(0.11mol/L)真空采血管采血至指定刻度,取血完毕立即轻轻颠倒混均混合均匀,不要剧烈震荡,并避免产生气泡。

  (四)及时离心,3000转/分离心标本10分钟,以除去血小板。

  (五)务必于采血后2小时内测定完毕,如不能完成试验,冷冻贮存少量血浆(0.5—1ml)(最好在-70℃,或者当贮存时间较短时,可以置于-20℃条件下),在实验前将血浆于37℃下快速融化。血浆用塑料试管存放,并用塑料吸管移取标本。

  十一、操作注意事项:

  (一) 许多的实验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及PH值上很小的变化都会导致试验结果明显的变化。孵育时间与温度是凝血酶原时间测定时应严格控制的参数。血浆绝不能在37°C下放置10min。

  (二) 实验前应检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血或出现凝块。

  十二、编写者:

  日 期:

  十三、科主任签字:

(实习编辑:陈战锋)

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